Skip to content

Mutacja STIM1 związana z zespołem niedoborów odporności i autoimmunizacji czesc 4

2 miesiące ago

572 words

Genomowy DNA otrzymany z 50 białych, zdrowych kontrolnych (reprezentujących w sumie 100 chromosomów) również zsekwencjonowano. PCR w czasie rzeczywistym wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem.14 Startery stosowane do amplifikacji komplementarnego DNA wymieniono w dodatkowym dodatku.
Immunoblot i przeciwciała
Przeprowadzono analizę cytometrii przepływowej limfocytów, testy na proliferację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i test apoptozy jak opisano uprzednio.17 Poziomy immunoglobulin w surowicy określono metodą nefelometryczną. Immunoblot przeprowadzono na podstawie standardowych protokołów.14 Przeciwciała przeciwko aktynie (sc-1616, Santa Cruz Biotechnology) i STIM1 (GOK, BD Biosciences) zostały zakupione. Poliklonalne przeciwciało przeciwko C-końcowej domenie STIM1 wytworzono przez immunizację królików konserwowanym 29-aminokwasowym peptydem odpowiadającym aminokwasom od 657 do 685 ludzkiego STIM1 (NP_003147), zgodnie ze standardowymi protokołami (Open Biosystems). Antysurowice oczyszczono metodą powinowactwa za pomocą immunizującego peptydu. Przeprowadzono jednokomórkowe pomiary wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2 +, jak opisano wcześniej.8 Dalsze szczegóły dotyczące procedur eksperymentalnych są dostępne w sekcji Metody dodatku uzupełniającego.
Wyniki
Oceny immunologiczne
Liczba limfocytów dla pacjentów V-1, V-4 i V-7 była nieznacznie zmniejszona lub normalna, z odpowiednim rozkładem populacji subpopulacji limfocytów. Zmniejszone proporcje naiwnych limfocytów T CD4 + i limfocytów T CD4 + CD45RA + CD31 + (ostatnio emigrantów z grasicy) stwierdzono dla Pacjenta V-1. Jej repertuar komórek T był prawidłowy, jak oceniono za pomocą przeciwciał monoklonalnych przeciw regionom zmiennym łańcucha . receptora komórek T (V.3, V.8, V.13-6, V.13-17 i V.21-3). Liczba limfocytów T regulatorowych CD4 + FOXP3 + była znacznie zmniejszona w próbkach krwi od Pacjenta V-1 (Tabela i Fig. w Dodatku Uzupełniającym). Proliferacja limfocytów T w odpowiedzi na fitohemaglutyninę, 13-octan 12-mirystynianu forbolu i jonomycyny lub przeciwciało anty-CD3 było umiarkowanie zmniejszone u Pacjentów V-1 i V-7, a ci dwaj pacjenci mieli ciężko upośledzone limfocyty T odpowiedzi na antygeny przypominające (wirus ospy wietrznej-półpaśca i toksoid tężcowy), pomimo dwóch epizodów ospy wietrznej (u pacjenta V-1) i jednej rundy szczepienia przeciwko błonicy, krztuścowi i tężcowi miesiąc przed badaniem odpowiedzi na antygeny przypominające (w Pacjent V-7). Apoptoza komórek T indukowana przez Fas była normalna u Pacjenta V-1. Stężenie IgG, IgA i IgM w surowicy mieściło się w granicach normy lub w granicach normy u pacjentów V-1 i V-7, podczas gdy poziom IgG był znacznie zmniejszony u pacjenta V-4, najprawdopodobniej w następstwie zespołu nerczycowego.
Mutacja bzdur w STIM1
Stymulacja fibroblastów przez thapsigargin, inhibitor scykloplazmatyczno-endoplazmatycznej retikulum Ca2 + ATP-azy, ujawniła wyraźny defekt w sterowanej opróżnieniem pozycji Ca2 + u Pacjenta V-1 w porównaniu z grupą kontrolną (Figura 1B). Normalnie, wyczerpywanie się wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2 + przez thapsigargin aktywuje wejście Ca2 + obsługiwane przez magazyn przez kanały CRAC. Uszkodzenie tego mechanizmu w fibroblastach Pacjenta V-1 przypomina wadliwy system Ca2 + prowadzony w sklepie z niedoborem ORAI1, w którym kanały CRAC nie są funkcjonalne.8,14 Jednak sekwencjonowanie genomowego DNA nie ujawniło mutacji w ORAI1 lub jego paralogach ORAI2 i ORAI3 u pacjenta V-1.
Analiza biochemiczna wykazała, że białka STIM są wymagane do aktywacji kanałów ORAI, 18,19, a obydwa eksperymenty interferencji RNA i transgeniczne modele myszy pokazują, że STIM1 jest niezbędny do wejścia Ca2 + z magazynem w wielu typach komórek.6,7, 20-23 Sekwencjonowanie genomowego DNA uzyskanego od Pacjenta V-1 dla mutacji STIM1 ujawniło mutację 3803881AA, co spowodowało insercję adeniny w eksonie 3 STIM1 między pozycjami 380 i 381 w sekwencji kodującej (Figura 1C).
[więcej w: radektomia, internista wikipedia, zabiegi laserowe szczecin ]

Powiązane tematy z artykułem: internista wikipedia radektomia zabiegi laserowe szczecin