Skip to content

Epilepsja, ataksja, głuchota sensoryczna, tubulopatia i mutacje KCNJ10 ad

4 tygodnie ago

450 words

Genotypy DNA czworga dzieci dotkniętych chorobą w rodzinie i rodziców trójki rodzeństwa dotkniętego tym rodowodem (ryc. 1A) zostały wygenerowane przy użyciu macierzy chipów polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) (GeneChip Human Mapping 10K Array Xba142 2.0, Affymetrix) zgodnie z zaleceniami producenta. Genotypy badano za pomocą wielopunktowej analizy parametrycznego wiązania i rekonstrukcji haplotypu przeprowadzonej za pomocą SimWalk (wersja 2.91) dla autosomalnego modelu recesywnego z pełną penetracją i częstością alleli choroby wynoszącą 0,001 (mapa SNP deCode z częstotliwościami alleli azjatyckich) .8 Dane zostały sformatowane za pomocą Mega2 (wersja 4.0) przez ALOHOMORA (wersja 0.30, Win32) .9,10 niespójności Mendeliana zostały sprawdzone przy użyciu programu PedCheck (wersja 1.1); mało prawdopodobne genotypy zostały odfiltrowane za pomocą Merlina (wersja 1.1, alpha 3) .11,12 Pliki wyjściowe haplotypu SimWalk zostały wizualizowane za pomocą HaploPainter.13 Sekwencjonowanie
Sekwencjonowaliśmy kompletny region kodujący i miejsca splicingowe KCNJ10, genu kodującego kanał potasowy, ulegającego ekspresji w mózgu, uchu wewnętrznym i nerce, we wszystkich dzieciach dotkniętych chorobą i ich niedotkniętych rodzicach, jak opisano wcześniej.14 Obecność zmian sekwencji była sprawdził co najmniej 100 etnicznie dobranych alleli kontrolnych.
Badania elektrofizjologiczne
Pomiary elektrofizjologiczne wykonano przy użyciu klasycznej dwuelektrodowej metody mikroelektrody napięciowej. Heterologiczna ekspresja zmutowanego i dzikiego typu KCNJ10 w oocytach Xenopus laevis została wytworzona, jak opisano wcześniej.15 Badania były zgodne z odpowiednimi przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. W skrócie, do oocytów wstrzyknięto od 4 do 20 ng komplementarnego RNA (cRNA), transkrybowanego przy użyciu mMessageMachine (Applied Biosystems), z ludzkiego KCNJ10 sklonowanego w wektorze pTLB. Pomiary przeprowadzono w 20 mM chlorku potasu przy -80 mV w co najmniej czterech partiach oocytów. Prądy specyficzne dla KCNJ10 w wstrzykniętych oocytach, w porównaniu z nie wszczepionymi oocytami, zostały potwierdzone przez blokadę z użyciem baru.
Myszy Knockout Kcnj10
Myszy nokautowe Kcnj10 wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem16 i dostarczono je przez dr. Clemens Neusch i Frank Kirchhoff, Instytut Medycyny Eksperymentalnej im. Maxa Plancka, Göttingen, Niemcy. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalne rady ds. Opieki nad zwierzętami i przeprowadzone zgodnie z niemieckimi przepisami regulującymi opiekę nad zwierzętami.
Mocz pobrano od myszy w wieku 3 dni i analizowano jak podano wcześniej. Elektrolity w moczu mierzyła Katja Huggel i dr François Verrey, University of Zürich, Zurich, Szwajcaria, z zastosowaniem chromatografii jonowej (Metrohm). .
Badania immunoenzymatyczne nerek od 12-tygodniowych myszy C57BL / 6 (Charles River) przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi metodami. 18 Inkubacja i obrazowanie z użyciem pierwotnych przeciwciał przeciwko KCNJ10 (Alomone), akwaporynie-2 (St. Cruz), kalbindynę (Sigma), NKCC2,19 i NCC20 przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami.
Analiza statystyczna
Elektrofizjologiczne eksperymenty in vitro i moczowody myszy zostały zinterpretowane za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu t Studenta porównującego efekt i odpowiednie kontrole
[podobne: kabiny toaletowe, sprzątanie domu, okna pasywne ]

Powiązane tematy z artykułem: kabiny toaletowe okna pasywne sprzątanie domu